一次性筷子微生物含量检验(川外青澜）

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实验报告

实验名称：    一次性筷子微生物含量检验
实验材料：
   锥形瓶、剪刀、生化培养箱、高压灭菌锅、摇床、显微镜、移液管（1毫升、10毫升）、培养皿、酒精灯、洗耳球、一次性筷子7双、培养基、革兰氏染液
    平板培养：将琼脂或明胶等凝胶状固体培养基制成平面状，然后在此平面上培养微生物或多细胞生物的细胞、组织或器官，这种培养称为平板培养，亦称平面培养。
    高温灭菌锅：利用压力饱和蒸汽对产品进行迅速而可靠的消毒灭菌设备，对医疗器械、敷料、玻璃器皿溶液培养基等进行消毒灭菌，是理想的设备。
    生化培养箱：具有制冷和加热双向调温系统，温度可控的功能，是生物、遗传工程、医学、环境保护、农林畜牧等行业的重要试验设备，广泛应用于低温恒温试验、培养试验、环境试验等。
    摇     床： 当筷子浸在水里时，用摇床来振荡此容器，使筷子上的细菌更多的溶解到水中。
    革兰氏染液：确定大肠菌群的存在
    牛肉膏琼脂培养基：培养细菌
    高氏一号培养基：培养放线菌
    PDA培养基：培养霉菌
    伊红美蓝培养基：是一种鉴别培养基，鉴别大肠杆菌。

实验原理：
   1、将一次性筷子浸泡于无菌水中并振荡，通过混合平板培养法测定菌落（细菌、霉菌、放线菌）数。
   2、大肠菌群是作为粪便污染指标的一类细菌，主要是以该菌群检测出的情况来表示食品及一次性餐具有否粪便污染。
    3、根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性、无芽孢、呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。
实验意义：
    本实验通过培养浸泡过一次性筷子的无菌水，检测其微生物的含量，从而说明一次性筷子对人体的危害。本实验假定菌液（浸泡过一次性筷子的无菌）中含有细菌、霉菌、放线菌和大肠菌群，通过含量测定，以上菌种如果超过了一定的国家标准，便会对人体产生危害。
实验步骤：
一、样品稀释液的制备
  1、消毒双手  用75%酒精浸泡的棉球清洗双手。
  2、将7双一次性筷子剪碎，浸泡于已盛有200ml无菌水500ml的锥形瓶中，密封瓶口，置于摇床内振荡40min.即可得到一次性筷子的浸泡液，即原液。
  3、原液静置约20~30s后，再用1ml无菌移液管吸取原液1ml移入9ml无菌水的试管中，吹吸三次，让菌液混合均匀，即成10-1 稀释液；再换一支1ml无菌移液管吸取10-1 菌液1ml移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸三次混匀，即成10-2稀释液。待用。
二、菌落数的测定
  1、细菌  
    将无菌平皿编上1、10-1、10-2号码，每一号码设置三个重复，用1ml无菌移液管按无菌操作要求吸取10-2稀释液各1ml放入编号10-2的三个平皿中，同法吸取10-1稀释液各1ml放入编号10-1的平皿中，吸取原液各1ml放入编号1的平皿中。然后在9个平皿中分别倒入已熔化并冷至45~50℃的牛肉膏琼脂培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基均匀混合，冷却后倒置，37℃培养1~2天后即可计数。
  2、霉菌
    同上操作将9个平皿分别放入菌液，然后在9个平皿中分别倒入已熔化并冷却至45~50℃的PDA培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷却后倒置，30℃培养4~7天即可计数
  3、放线菌
    将各种浓度的菌液中加入10%酚液5~6滴。同上操作9个平皿分别放入菌液，然后在9个平皿中分别倒入已熔化并冷却至45~50℃的高氏一号培养基，轻轻转动平板使菌液与培养基混合均匀，冷凝后倒置，30℃培养2天即可计数。
  4、大肠菌群
    大肠菌群检验如下：


























将装有9ml单倍乳糖发酵管编号1、10-1、10-2号码，每一编号设置三个重复。用1ml无菌移液管按无菌操作要求吸取10-2稀释液各1ml放入编号10-2的三支乳糖发酵管中；吸取10-1稀释液各1ml放入编号10-1的三支乳糖发酵管中；再吸取原液各1ml放入编号1的三支乳糖发酵管中，摇匀，37℃培养24h。
经24h培养后，将产酸产气的发酵管分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板（EMB平板）上37℃培养18~24h。大肠菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略带有或不带有金属光泽；或者呈淡紫红色，仅中间颜色较深。挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。
正式试验：将革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌落的剩余部分接种于单倍乳糖发酵管中。如果产酸有产气，即证实达产菌群的存在。
实验流程图示：
各种培养基制作







  已配制好的培养基：

样品稀释液的制备
用摇床振荡

稀释菌液


细菌菌落总数测定
1、用移液管吸取1ml菌液

2、将菌液接种于培养皿

3、向已经接种的培养皿中倒入牛肉膏蛋白胨培养基（倒平板）

4、冷却至培养基凝固

5、将平板用报纸包好，放入37℃培养箱培养24h左右



6、约24h后可菌落计数

霉菌与放线菌的菌落总数测定的操作同上。
大肠菌群的检测
1、乳糖发酵接种


37℃培养24h左右，观察






经过24h发酵后



    如上图片显示：最右边的一支试管是在9ml单倍乳糖发酵管理加了1ml无菌水作为空白对照，该试管内培养基没有发生任何改变。接种菌液的9支试管中有8支变黄（产酸），而且在杜氏小管内顶端产生了气泡，即有可能是大肠菌群阳性。10-2稀释菌液其中一支为大肠菌群阴性。
   
   
   
   
2、使用划线分离培养法，将显示大肠菌群养性的8支发酵管接种于伊红美蓝琼脂平板上。
倒伊红美蓝琼脂平板

划线接种、37℃培养24h左右

3、革兰氏染色、镜检

经镜检，8个平板中有有7个存在革兰氏阴性无芽孢杆菌，即该7个平板中所挑取的菌落可能为大肠菌群。
4、将该7个平板中相应的菌落有接种于单倍乳糖发酵管中培养、观察




37℃培养24h左右


最后计算二氧化硫的含量
实验结果及分析：
细菌菌落数（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基）
各稀释度的平均菌落数    两稀释度之比    菌落总数cfu/ml    报告方式cfu/ml
1    10-1    10-2            
多不可计    166    44    2.7    1660    1.6×103
    每双筷子的细菌总数=1.6×103cfu/ml×200ml÷7=4.6×104
   
放线菌培养失败


霉菌菌落数（PDA培养基）
各稀释度的平均菌落数    两稀释度之比    菌落总数cfu/ml    报告方式cfu/ml
1    10-1    10-2            
多不可计    263    96    3.6    2630    2.6×103
每双筷子的霉菌总数=2.6×103 cfu/ml ×200ml÷7=7.4 ×104  
大肠菌群的检验结果：
菌液    1    10-1    10-2
大肠菌群阳性管数    2    3    2
按大肠菌群检验结果在大肠菌群检数表上查找，得出浸泡过一次性筷子后的菌液的大肠菌群数为4400个每升（参考于：大肠菌群检数表），严重超标（国家规定每升水中大肠菌群不能超过3个）。

结果分析：
    从实验数据可以得出一次性筷子中的微生物总数（细菌、霉菌、大肠菌群）严重超标，实验使用的是7双一次性筷子，并将其浸泡于200ml无菌水中。经计算可得出：每双筷子所含细菌总数约为4.6×104、霉霉菌总数为7.4 ×104 、大肠菌群数为4400个每升。


感谢重庆师范大学生物协会的专业支持！
  

无知人士

小佳佳，爱死你勒。。。。

nirvana

呵呵、这个。。。应该对我说。。。。
这个研究很专业哈。。。

无知人士

嗯，那你搞吧